目前mRNA检测常用的三种方法:荧光定量PCR,数字PCR、转录组二代测序。
qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。每扩增一条DNA链,就有荧光染料分子结合到双链DNA上或有荧光分子从探针上释放,实现荧光信号的累积。由于荧光积累与PCR产物形成完全同步,可通过软件对荧光积累信息进行分析和计算,获得待测样品模板的初始浓度。但是,qPCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量,无法做到精准绝对定量。并且受检测方法的局限性,每次检测的基因数不易太多,且需要的样本量比较大。
数字PCR是新兴起来的一种核酸分子绝对定量技术。该技术可直接获得DNA分子的拷贝数,实现起始样品中核酸分子的绝对定量,且无需标准品或内标。数字PCR已经被广泛应用到医学、生物学等各个领域,如拷贝数变异、突变检测、复杂来源样品中低丰度核酸分子检测等方面。但该技术需要的仪器和试剂价格昂贵,操作复杂,检测周期长,检测范围较窄,目前普及率还不是很高。
NGS功能强大,适合用于探索筛选新的生物标志物,但是实验操作较复杂,数据分析难度较大,检测周期长,成本较高。善准独特的目标基因mRNA测序,正好弥补了NGS检测的缺点。首先基因可以定制,完全按客户的需求定制需要检测的目的基因,从几十个到几百个,不受数量限制。另外由于不需要检测不相关的其他基因,能很好的控制检测成本,与转录组每个样本需要10G左右的下机数据相比,该方法1个G可以做30个样本,检测速度和成本都有绝对优势。
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qPCR |
数字PCR |
mRNA靶向测序 |
定量能力 |
相对定量,需要标准品和标准曲线 |
绝对定量 |
相对定量,只需要加入参考基因 |
操作简便性 |
简单 |
中等 |
复杂 |
所需样本量 |
高 |
高 |
低 |
设备依赖度 |
低 |
高 |
低 |
数据分析 |
易 |
易 |
适中 |
多基因检测成本 |
中 |
高 |
低 |
检测通量 |
低 |
低 |
高 |
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